雜交瘤技術的基本原理

一單克隆抗體的制備

1975年kǒhler和milstein首先報道用細胞雜交技術使經(jīng)綿羊紅細胞（srbc)免疫的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合，建立起第一個b細胞雜交瘤細胞株，并成功地制得抗srbc的單克隆抗體（monlclonalantibody,MCAB）。迄今世界已研制成數(shù)以千計的mcab。

單克隆抗體的理化性狀高度均一，生物活性單一，與抗原結(jié)合的特異性強，便于人為處理和質(zhì)量控制，并且來源容易，所以一問世便受到歡迎和重視。在醫(yī)學領域中，mcab在診斷疾病、判斷預后、防治疾病以及疾病機制研究等方面起著巨大的促進作用。為此，兩位發(fā)明者于1984年獲得諾貝爾醫(yī)學獎。

第一節(jié)雜交瘤技術的基本原理

雜交瘤抗體技術的基本原理是通過融合兩種細胞而同時保持兩者的主要特征。這兩種細胞分別是經(jīng)抗原免疫的小鼠細胞作小鼠骨髓瘤細胞。脾淋巴細胞的主要特征是它的抗體分泌功能和能夠在選擇培養(yǎng)基中生長（選擇原理后見），小鼠骨髓瘤細胞則可在培養(yǎng)條件下無限分裂、增殖，即所謂永生性。在選擇培養(yǎng)基的作用下，只有b細胞與骨髓瘤細胞融合的雜交才具有持續(xù)增殖的能力，形成同時具備抗體分泌功能和保持細胞永生性兩種特征的細胞克隆。其原理從下列幾個主要步驟闡明。

（一）細胞的選擇與融合

建立雜交瘤技術的是制備對抗原特異的單克隆抗體，所以融合細胞一方必須選擇經(jīng)過抗原免疫的b細胞，通常來源于免疫動物的碑細胞。脾是b細胞聚集的重要場所，無論以何種免疫方式刺激，脾內(nèi)皆會出現(xiàn)明顯的抗體應答反應。融合細胞的另一方則是為了保持細胞融合后細胞的不斷增殖，只有腫瘤細胞才具備這種特性。選擇同一體系的細胞可增加融合的成功率。多發(fā)性骨髓瘤是b細胞系惡性腫瘤，所以是理想的脾細胞融合伴侶。目前常用的b細胞瘤株有：p3-x63-ag8(kǒhlerandmilstein，1975)，p3-nsi/1-ag4-1(kǒhlerandmilstein，1976)，x63-ag8.563(kearneyetal，1979)，sp2/0-ag14(schulmanetal，1978)等，這些細胞株皆為hat敏感細胞株。

使用細胞融合劑造成細胞膜一定程度的損傷，使細胞易于相互粘連而融合在一起。最佳的融合效果應是最低程度的細胞損傷而又產(chǎn)生最高頻率的融合。聚乙二醇（peg1000～2000）是目前最常用的細胞融合劑，一般應用濃度為40％（w/v）。

（二）選擇培養(yǎng)基的應用

細胞融合是一個隨機的物理過程。在小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞混合細胞懸中，經(jīng)融合后細胞將以多種形式出現(xiàn)。如融合的脾細胞和瘤細胞、融合的脾細胞和脾細胞、融合的瘤細胞和瘤細胞、未融合的脾細胞、未融合的瘤細胞以及細胞的多聚體形式等。正常的脾細胞在培養(yǎng)基中存活僅5～7天，無需特別篩選，細胞的多聚體形式也容易死去。而未融合的瘤細胞則需進行特別的篩選去除。

細胞dna合成一般有兩條途徑。主途徑是由糖和氨基酸合成核苷酸，進而合成dna，葉酸作為重要的輔酶參與這一合成過程。另一輔助途徑是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情況下，經(jīng)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（hgprt）和胸腺嘧啶核苷激酶（tk）的催化作用合成dna。細胞融合的選擇培養(yǎng)基中有三種關鍵成分：次黃嘌呤（hypoxanthine，h）、氨甲蝶呤（aminopterin，a）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，t），所以取三者的字頭稱為HAT培養(yǎng)基。氨甲蝶呤是葉酸的拮抗劑，可阻斷瘤細胞利用正常途徑合成dna，而融合所用的瘤細胞是經(jīng)毒性培養(yǎng)基選出的hgprt－細胞株，所以不能在該培養(yǎng)基中生長。只有融合細胞具有親代雙方的遺傳性能，可在hat培養(yǎng)基中長期存活與繁殖（圖11-1）。

（三）有限稀釋與抗原特異性選擇

在動物免疫中，應選用高純度抗原。

一種抗原往往有多個決定簇，一個動物體在受到抗原刺激后產(chǎn)生的體液免疫應答，實質(zhì)是眾多b細胞群的抗體分泌。而針對目標抗原表位的b細胞只占極少部分。由于細胞融合是一個隨機的過程，在已經(jīng)融合的細胞中，有相當比例的無關細胞的融合體，需細篩選去除。

篩選過程一般分為兩步進行：一是融合細胞的抗體篩選，二是在此基礎上進行的特異性抗體篩選。將融合的細胞進行充分稀釋，使分配到培養(yǎng)板的每一孔中的細胞數(shù)在0至數(shù)個細胞之間（30％的孔為0才能保證每個孔中是單個細胞），培養(yǎng)后取上清以elisa法選出抗體高分泌性的細胞；這一過程常被習慣地稱作克隆化。將這些陽性細胞再進行克隆化，應用特異性抗原包被的elisa找出針對目標抗原的抗體陽性細胞株，增殖后進行凍存、體外培養(yǎng)或動物腹腔接種培養(yǎng)。