熱滅活是為了去除血清中補(bǔ)體等對(duì)熱敏感的物質(zhì)。

解釋

血清的熱滅活是很多培養(yǎng)者感興趣的話題,價(jià)格不菲的血清中含有諸如生長(zhǎng)因子,維生素,氨基酸等珍貴物質(zhì),而將它們置于50℃以上的溫度長(zhǎng)達(dá)30分鐘是完全沒(méi)有必要的。盡管如此,在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室之中血清的熱滅活還是作為常規(guī)來(lái)執(zhí)行,多數(shù)實(shí)驗(yàn)者并沒(méi)有考慮熱處理對(duì)血清中的生長(zhǎng)因子,氨基酸等成分帶來(lái)的負(fù)面影響。

簡(jiǎn)介

根據(jù)調(diào)查,至少70%的研究者對(duì)血清的滅活僅僅是因?yàn)樽裾粘R?guī)操作,或者說(shuō)認(rèn)為是理所當(dāng)然的。常規(guī)滅活建議的溫度在45℃到62℃之間,而時(shí)間則從15分鐘到60分鐘不等。其中最常用的手法是56℃熱處理30分鐘。隨著血清采集、處理、加工工藝的提高,許多早先認(rèn)為是熱滅活的原因已經(jīng)不再成立,只有少數(shù)對(duì)血清進(jìn)行熱滅活的研究者在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了這一步驟的有效性和必要性。

熱滅活目的是為了去除血清中補(bǔ)體等對(duì)熱敏感的物質(zhì),但是在胎牛血清中對(duì)補(bǔ)體的滅活則明顯沒(méi)有必要。Triglia和Linscott曾對(duì)商業(yè)胎牛血清中的補(bǔ)體成分進(jìn)行測(cè)定,他們發(fā)現(xiàn)胎牛血清中含有的C1,C6僅達(dá)成年動(dòng)物血清的1-3%,而其它補(bǔ)體成分僅有成年動(dòng)物的5-50%,至于補(bǔ)體的主要成分C3在胎牛血清中則幾乎不能檢出。通過(guò)補(bǔ)體固定實(shí)驗(yàn),我們也在多個(gè)不同批次的胎牛血清中獲得了相似的結(jié)果。即使是在未稀釋的血清中,也未發(fā)現(xiàn)有明顯的溶血現(xiàn)象。另外,多數(shù)實(shí)驗(yàn)室在培養(yǎng)前將培養(yǎng)液進(jìn)行預(yù)熱的過(guò)程,也對(duì)熱敏的補(bǔ)體有滅活的作用。

在對(duì)補(bǔ)體滅活以外,熱處理同時(shí)也對(duì)血清中可能存在的支原體具有滅活作用。多年以前,450納米孔徑的濾膜被用于加工血清時(shí),血清中支原體的污染時(shí)有發(fā)生。針對(duì)這個(gè)問(wèn)題,HyClone首家使用100納米三層濾膜連續(xù)濾過(guò)技術(shù),自從采用這項(xiàng)技術(shù)以及后來(lái)的40納米濾過(guò)技術(shù)之后,我們的血清產(chǎn)品中沒(méi)有再發(fā)現(xiàn)有支原體的污染,也是使得熱滅活成為不必要的另外一個(gè)原因。

Pinyopummintr等證明血清去除滅活步驟不影響牛胚胎的發(fā)育分化;有研究結(jié)果證實(shí)熱滅活步驟減弱了胎牛血清和小牛血清對(duì)細(xì)胞的促粘附作用,在用SV-BHK、BALB-3T3、CV-1、FS-4細(xì)胞對(duì)細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)中,熱滅活對(duì)胎牛血清的影響小于對(duì)小牛血清的影響。

我們調(diào)查了熱滅活對(duì)胎牛血清以及對(duì)其中不同細(xì)胞株生長(zhǎng)能力的影響。通過(guò)比較11個(gè)不同細(xì)胞株,發(fā)現(xiàn)其中熱滅活對(duì)6個(gè)細(xì)胞株(HBAE,MDBK,Vero,成纖維細(xì)胞,MRC-5)的生長(zhǎng)帶來(lái)負(fù)面影響,三個(gè)細(xì)胞株(FOX-NY,MDCK和CHO-K1)不受熱滅活的影響,而只有兩個(gè)細(xì)胞株(Balb/3T3,Sp2/0Ag14hybrid),在熱滅活之后,細(xì)胞生長(zhǎng)有輕微的改善。所以,在正常的操作下,熱滅活通常對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用。

在正常操作下,熱滅活經(jīng)常給血清產(chǎn)品帶來(lái)負(fù)面的影響,對(duì)血清的加熱經(jīng)常導(dǎo)致血清中沉淀的產(chǎn)生,而導(dǎo)致的沉淀又常常被認(rèn)為是微生物的污染。注意到這個(gè)現(xiàn)象之后,為了驗(yàn)證污染的存在,或者促進(jìn)沉淀的溶解,許多培養(yǎng)者往往將血清放置37℃溫育。這卻往往使情況變得更糟,血清中的蛋白進(jìn)一步的析出,為了確信血清未被污染,進(jìn)行的鏡檢,無(wú)菌培養(yǎng)試驗(yàn),和革蘭氏染色試驗(yàn)更是浪費(fèi)了實(shí)驗(yàn)者大量的時(shí)間和精力。

總之,多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)中血清的熱滅活并不是必要的。很多場(chǎng)合下,熱滅活并不會(huì)改善細(xì)胞的生長(zhǎng),卻降低了支持細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。即使在少數(shù)有促進(jìn)的情況下,其促進(jìn)的比率也是微不足道的。另外,血清的熱滅活導(dǎo)致的沉淀常常被認(rèn)為是微生物的污染,從而給用戶和供應(yīng)商都帶來(lái)不必要的麻煩。我們建議,對(duì)于那些對(duì)血清進(jìn)行滅活的用戶,需要通過(guò)試驗(yàn)來(lái)證實(shí)其必要性,確定滅活的適當(dāng)條件;在滅活過(guò)程中,需要嚴(yán)格認(rèn)真監(jiān)測(cè),并選擇一個(gè)可重復(fù)的方案進(jìn)行操作。