概括介紹

原位雜交早在1969年開始使用，并于1981年開始用于RNA 的原位雜交檢測[1, 2] 。

RNA原位雜交方法有：

傳統(tǒng)RNA 原位雜交

Isotopic ISH

使用放射性標(biāo)記的RNA探針進(jìn)行的。Isoptopic ISH 可以達(dá)到高敏感性，但是需要很長的曝光時(shí)間（數(shù)天到數(shù)周），同時(shí)只提供有限的形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)。該種雜交方法由于使用的探針很長，曝光時(shí)間也很長，所以存在非特異性雜交以及長時(shí)間曝光導(dǎo)致與高背景干擾信號產(chǎn)生。由于以上問題以及放射性污染，從而限制了此項(xiàng)技術(shù)的普遍應(yīng)用。

非-ISOTOPIC ISH

熒光標(biāo)記或者生物素寡核苷酸探針的應(yīng)用極大程度地促進(jìn)了RNA原位雜交的應(yīng)用，該方法縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，同時(shí)達(dá)到了放射性探針的雜交敏感性。這類探針可以在雜交后通過熒光或者可見光酶促反應(yīng)成像。作為一種DNA探針的替代物，RNA探針使用ribo探針，該探針可以通過體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，通常有幾百個(gè)堿基。與DNA寡核苷酸探針相比，ribo探針可以和目標(biāo)RNA形成更加穩(wěn)定的雜交，從而允許使用高強(qiáng)度的洗脫條件來增加非特異性。但是，由于RNA的天然特性，使得該類探針的標(biāo)記物位點(diǎn)有限，由于存在非特異性結(jié)合導(dǎo)致較高的非特異性雜交，導(dǎo)致DNA 寡核苷酸探針與RNA riboprobes 探針的信噪比無法有效控制。另外，在檢測靈敏度上也有一定局限。對于低水平表達(dá)或者部分降解的RNA，不能做到很好的檢測。

直接法RNA 原位雜交

直接檢測RNA 原位雜交方法，例如目前市場上Biosearch 公司（Stellaris ? , Biosearch TechnologiesPetaluma, CA）使用直接熒光標(biāo)記的小的單鏈寡核苷酸探針。多個(gè)探針設(shè)計(jì)針對每個(gè)目標(biāo)RNA，每個(gè)與一小段序列互補(bǔ)，它們結(jié)合延伸至整個(gè)序列的長度。以這種方式，使用多個(gè)探針可以確保提高靈敏度，并且在不可避免的一個(gè)或兩個(gè)探針非特異性雜交背景下熒光信號足以觀測到。由于直接檢測標(biāo)記的探針，這項(xiàng)技術(shù)是簡單而快速的。然而，該技術(shù)的靈敏度和信噪比仍然很局限，需要專門的去背景算法進(jìn)行結(jié)果分析。

新一代RNA原位雜交

RNAscope? 原位雜交

RNAscope?專利技術(shù)是近年來最火的RNA原位雜交技術(shù)，是RNA原位雜交（ISH）領(lǐng)域的一項(xiàng)重大進(jìn)步。由Advanced Cell Diagnostics公司（Newark, CA）開發(fā)，通過專利的雙“Z”探針設(shè)計(jì)和信號放大系統(tǒng)，使RNA原位雜交具有高度特異性、單分子檢測的敏感性并有極高的信噪比，能夠在單細(xì)胞水平同時(shí)定量多個(gè)RNA的表達(dá)，在獲得單細(xì)胞中單拷貝RNA表達(dá)數(shù)據(jù)的同時(shí)提供完整的組織形態(tài)學(xué)信息。

RNAscope 方法克服了以前的RNA原位雜交技術(shù)的非特異性雜交、靈敏度低、對樣本要求高等弱點(diǎn)，可替代傳統(tǒng)的ISH/FISH RNA 原位檢測，同時(shí)單分子檢測靈敏度提供了在組織細(xì)胞原位對單個(gè)細(xì)胞中基因的表達(dá)進(jìn)行檢測，釋放RNA作為生物標(biāo)記的全部潛能，提高對疾病與標(biāo)志物之間復(fù)雜的生物學(xué)相關(guān)性的認(rèn)識，是理想的能夠用于NGS和芯片技術(shù)后期轉(zhuǎn)化研究技術(shù)平臺。

RNAscope? 原位雜交步驟：

RNAscope?原位雜交是一項(xiàng)新穎的用于檢測位于組織細(xì)胞原位的目標(biāo)RNA的原位雜交（In Situ Hybridization，ISH)檢測技術(shù)。該技術(shù)進(jìn)行RNA原位雜交檢測主要分成5步。

Step 1：

透化：通過RNAscope?預(yù)處理試劑盒處理載玻片上固定好的組織或細(xì)胞，暴露目標(biāo)RNA。

Step 2：

探針雜交：針對靶基因設(shè)計(jì)RNAscope?專利Z型探針與目標(biāo)RNA雜交。

Step 3：

信號放大：RNAscope?檢測試劑盒逐級信號放大。

Step 4：

信號可視化：在普通光學(xué)顯微鏡或者多光譜熒光成像系統(tǒng)下，每一個(gè)目標(biāo)RNA分子以一個(gè)點(diǎn)狀信號的形式呈現(xiàn)。

Step 5：

量化分析：顯微鏡下直接計(jì)數(shù)或者使用圖像分析軟件如RNAscope? SpotStudio? 或HALO對每一個(gè)細(xì)胞中的RNA單分子信號進(jìn)行精確定量分析。